SEJARAH PERKEMBANGAN DAN PERANAN BIOLOGI MOLEKULER

08 March 2015 08:41:24 Dibaca : 814 Kategori : COURSE


Biologi Molekuler merupakan cabang ilmu pengetahuan yang mempelajari hubungan antara struktur dan fungsi molekul-molekul hayati serta kontribusi hubungan tersebut terhadap pelaksanaan dan pengendalian berbagai proses biokimia. Secara lebih ringkas dapat dikatakan bahwa Biologi Molekuler mempelajari dasar-dasar molekuler setiap fenomena hayati.
Meskipun sebagai cabang ilmu pengetahuan tergolong relatif masih baru, Biologi Molekuler telah mengalami perkembangan yang sangat pesat semenjak tiga dasawarsa yang lalu. Kebanyakan dari kemajuan-kemajuan itu pada awalnya adalah berkat kerja yang baik para peneliti yang memberi perhatian pada jasad renik. Menurut Francois Jacob dan James D. Watson penemuan sukses di tahun 1950-an dan 960-an yang dapat digunakan dalam mempelajari sel dan organ pada organisme tingkat tinggi  adalah berupa :
1.      Penemuan struktur DNA
2.      Peranan RNA (sintesis protein)
3.      Kode genetik
4.      Cara pengaturan gen pada bakteri
Telah diadakan pendekatan molekuler dalam biologi dan akan sangat mempengaruhi tiap disiplin ilmu dalam biologi seperti :
1.      Histologi : bidang biologi yang mempelajari tentang struktur jaringan secara detail menggunakan mikroskop pada sediaan jaringan yang dipotong tipis. Histologi dapat juga disebut sebagai ilmu anatomi mikroskopis.
2.      Sitologi : ilmu yang mempelajari tentang sel. Pemeriksaan sitologi yang sering digunakan untuk mendeteksi kanker payudara adalah dengan cairan antara selaput pembungkus paru (cairan pleura).
3.      Anatomi : cabang dari biologi yang berhubungan dengan struktur dan organisasi dari makhluk hidup.
4.      Embriologi : cabang ilmu yang mempelajari perkembangan embrio
dalam rahim ibu.
5.      Genetika : cabang biologi yang mempelajari pewarisan sifat pada organisme maupun suborganisme (seperti virus dan prion)
6.      Fisiologi : turunan biologi yang mempelajari bagaimana kehidupan berfungsi secara fisik dan kimiawi.
7.      Evolusi : ilmu yang mempelajari perubaan-perubahan pada makhluk hidup dalam jangka waktu yang sangat lama.
Perbedaannya adalah, pada saat itu para ahli biologi dalam studinya menggunakan sel-sel prokariotik, terutama suatu tipe bakteri Eschericia coli. Berbeda dengan waktu ini yang menggunakan sel eukariotik. Tetapi kebanyakan sifat-sifat yang menyebabkan organisme tingkat tinggi berbeda dengan bakteri sekarang sudah dapat ditunjukkan pada tingkat molekuler.
Pada akhir abad ke-19 timbul 2 teori, yaitu teori evolusi dan teori sel, yang mendorong adanya konversi dalam biologi dari masa lalu yang observasional menjadi ilmu eksperimental yang aktif.dalam teori evolusinya, Darwin dan Wallace melihat ketidaktetapan dunia hayati. Mereka mengajuka hipotesa bahwa perubahan-perubahan massa tanah, fluktuasi suhu dan hujan lokal, dan perubahan iklim jangka lama, merupakan penyebab ‘seleksi alam’. Di lingkungan selektif itu dapat muncul jenis-jenis baru, sedang jenis –jenis lama yang tidak bisa menyesuaikan diri akan mati.
Pada akhir abad ke-17 ahli berkebangsaan Belanda, Anton Van Leeuwenhoek, membuat mikroskop yang pertama. Alat ini menunjukkan padanya adanya partikel-partikel kecil yang tidak dapat dilihat dengan mata biasa. Pada waktu yang hampir bersamaan, Robert Hooke mengamati unitunit mikroskopik yang menyusun gabus, suatu jaringan mati. Ia menamakan unit-unit tersebut sel. Setelah mikroskop yang modern, teknik-teknik pengawetan jaringan, serta alat-alat untuk membuat irisan tipis telah ada pada awal abad ke-19 para penyelidik tidak hanya melihat bahwa jaringan disusun oleh unit-unit sel, tetapi juga bahwa sel-sel dapat membelah. Mulailah diketahui bahwa tiap sel menunjukkan kehidupan. Hingga dapat dinyatakan bahwa ada satu prinsip universal mengenai perkembangan untuk bagian-bagian dasar pada organisme, walaupun berbeda, dan prinsip ini adalah pembentukan sel-sel.
Menurut kepercayaan orang dahulu tidak ada suatu bagianpun dari organisme yang dulunya hidup. Selain itu, dulu diduga bahwa suatu bentuk primitif protoplasma, suatu “blastema primitif”, merupakan bahan asal kebanyakan organisme. Namun, teori sel sangat melemahkan pendapat ini dengan dalil organisme dapat timbul dari organisme-organisme penyusunnya.suatu kesimpulan dari teori sel adalah paling penting jika sel-sel masing-masing dapat tumbuh dan membelah, maka sel-sel itu adalah subyek yang cocok untuk studi organisme hidup. Sbelum jaman Louis Pasteur, organisme bersel satu yang diamati Leeuwenhoek dianggap timbul sebagai “generatio spontanea”. Tetapi percobaan Pasteur memunyai bobot untuk melawan konsep tersebut. Menjelang akhir abad ke-19 teori sel diterima secara luas dan dasar biologi modern telah ada.
Pada awal abad ke-19 ditemukan bahwa suatu bagian utama ekstrak yang berasal dari sel-sel tumbuhan dan hewan adalah bahan yang sangat kompleks yang menghasilkan endapan “fibrous” jika ekstrak tersebut dipanasi atau dicampur dengan asam.G.J. Mulder berkesimpulan di tahun 1838 bahwa bahan “fibrous” tersebut adalah protein. Pada tahun 1900, 16 dari 20 asam amino standard yang menjadi penyusun protein telah diketahui.Pada tahun 1865 hukum-hukum dasar pewarisan ditemukan oleh Gregor Mendel. Namun kesimpulan-kesimpulannya ini jauh lebih awal dari ilmu yang bersangkutan sehingga diabaikan begitu saja. Baru pada tahun 1900 kesimpulan-kesimpulan tersebut diterima dalam dunia ilmu pengetahuan. Adalah suatu hal yang wajar jika teori sel mengakar lebih kuat dahulu sebelum para ahli biologi memahami hubungan antara genetika Mendel dengan pembelahan sel. Setelah itu orang memalingkan perhatiannya kepada sperma dan sel telur yang persatuannya merupakan langkah pertama dalam semua pembelahan sel pada organisme tingkat tinggi. Berkat penemuan ini selanjutnya berkembang dan diketahui proses-proses pembelahan mitosis dan meiosis. Tidak hanya berhenti disitu, para ahli biologi semakin gencar melakukan penelitian dan mendapatkan penemuan yang berguna bagi dunia ilmu pengetahuan, mulai dari inti sel dan kromosom, enzim, DNA (menetapkannya sebagai bahan genetik), struktur DNA, virus, basa nitrogen, dan banyak lagi. Sejak tahun 1975 teknik-teknik baru telah memungkinkan manusia untuk mengisolasi segmen DNA dan memurnikannya dalam jumlah besar. Pada umumnya pendekatan molekuler diterapkan pada sel-sel euakariotik.



Perbedaan    Sebelum berkembang pesat    Sesudah berkembang pesat
1.      objek    prokariotik    eukariotik
2.      faham    generatio spontanea    berasal dari mikroba yang ada di udara


1.1 Latar Belakang
    Perkembangan ilmu biologi molekuler di dunia begitu pesat,hal ini dipengaruhi oleh perubahan pola fikir dan keadaan wilayah sehingga banyaknya ilmu-ilmu yang mempelajari bagaimana memaksimalkan DNA dan mempelajari perubahan DNA (genetik) karena perubahan lingkungan maupun karena hal lainnya. Sehingga berbagai pihak harus bisa mengerti dan paham akan fenomena ini,salah satunya profesi dokter hewan di Indonesia.
    DNA merupakan pembawa informasi genetik yang akan diturunkan kepada generasi penerusnya (Anonim,2010) ,sehingga dengan memodifikasi informasi ini akan menghasilkan generasi baru yang bisa bersaing dan mendapatkan keuntungan berlimpah,baik dari segi budaya maupun ekonomi serta sosial. Sehingga ilmu ini sangatlah bermanfaat bagi umat manusia.
    Ilmu dasar yang harus dimiliki untuk bisa mengolah data genetik yaitu harus mengetahui dan memahami teknik Isolasi DNA,Amplifikasi DNA dengan PCR,Uji Polimerisme dengan teknik RFLP dan Elektroforesis Gel Poliakrilamid. Dimana praktikum tersebut saling berhubungan antara satu dengan yang lainnya (Suryanto Dwi,2010)
    Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNA murni yang bebas dari RNA maupun protein lainnya hal ini didasarkan pada proses sentrifugasi (berat molekul),kemudian dilanjutkan dengan amplifikasi DNA dengan PCR. Hal tersebut bermanfaat dalam memperbanyak jumlah DNA agar bisa dimanfaatkan lebih maksimal karena jumlahnya lebih banyak. Kemudian diidentifikasi dengan proses RFLP agar tahu variasi-variasi dari bahan genetic tersebut. Dan hasilnya dilihat menggunakan Elektroforesis Gel Poliakrilamid untuk mengetahui visualisasi dari semua praktikum diatas. Agar bisa ditentukan berat molekul dan menentukan keberhasilan teknik tersebut.
    Berdasarkan latarbelakang di atas, praktikum “Isolasi DNA,AmplifikasiDNA dengan PCR,Uji Polimersime dengan teknik RFLP dan Elektroforesis Gel Poliakrilamid” dirasa sangat dibutuhkan oleh Dokter Hewan. Selain itu,praktikum ini merupakan salah satu cara memenuhi kewajiban dari pihak akademik fakultas agar menghasilkan lulusan yang bisa bersaing secara nasional maupun internasional.

1.2 Tujuan
•    Untuk memperoleh Isolat DNA pada berbagai makluk hidup ( Isolasi DNA )
•    Untuk memperbanyak jumlah DNA agar bisa digunakan untuk analisis maupun penelitian. (Amplifikasi DNA dengan PCR)
•    Untuk mengetahui keanekaragaman genetic maupun variasi–variasinya ( Uji polimersime dengan teknik RFLP )
•    Untuk memurnikan maupun memisahkan suatu molekul baik protein maupun asam nukleat berdasarkan perbedaan ukurannya ( Elektroforesis Gel Poliakrilamid )

1.3 Manfaat
•    Memberikan pengetahuan seputar karakteristik dari DNA pada suatu makluk hidup khususnya pada praktikum ini DNA sapi (darah sapi). (Isolasi DNA)
•    Memberikan pengetahuan akan keragaman genetic maupun cara seleksi maupun uji kemurnian pada bahan tersebut (Amplifikasi DNA dengan PCR)
•    Memberikan pengetahuan akan variasi-variasi genetic beserta pemetaan genetic,penentuan mutasi,kekerabatan dan hal-hal yang berhubungan jenis genetic. ( Uji polimersime dengan teknik RFLP )
•    Memberikan pengetahuan tentang perbedaan ukuran dari DNA hasil PCR dsb serta berperan dalam mempurifikasikan DNA tersebut dan proses-prosesnya. ( Elektroforesis Gel Poliakrilamid ).


BAB II
METODOLOGI

2.1 Waktu dan Tempat
    Praktikum Isolasi DNA ,Amplifikasi DNA dengan PCR,Uji Polimerisme dengan Teknik RFLP dan Elektroforesisi Gel Poliakrilamid dilakukan pada tanggal 05 November 2012 jam 13.00 – 18.00 WIB di Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA) Universitas Brawijaya,Malang.

2.2 Alat dan Bahan
    2.2.1 Isolasi DNA
    Peralatan yang digunakan pada praktikum Isolasi DNA antara lain microtube atau eppendorf steril,kemudian mortar,microcentrifugastor,micropipette,vortex dan inkubator. Kemudian bahan yang dibutuhkan antara lain ; darah sapi,larutan buffer ekstrak atau buffer lysis,PCI (Phenol Chloroform Isoamil Alkohol), Ethanol atau Alkohol 70% dan dd H2O steril.

    2.2.2 Amplifikasi DNA dengan PCR
    Adapun perlatan yang digunakan antara lain ; Thin Wall, Laminar Air Flow (LAF) ,Mikropipet,Mikrotube (tabung 1,5 ml),Yellow Tip , Mesin PCR/Thermal cycler,Spin down/mesin sentrifugasi,Masker dan Gloves. Serta juga dibutuhkan beberapa bahan seperti ddH2O,PCR mix,DNA Template / Whole genom (diambil dari darah sapi),Primer forward (satelit IV) dan Primer reverse (satellite IV).
     
    2.2.3 Uji Polimerisme dengan Teknik RFLP
    Bahan yang digunakan antara lain ; ddH2O 5µl,Buffer enzim 2x sebanyak 1 µl,DNA hasil PCR sebanyak 3 µl,dan enzim Hind III 1 µl serta ditambahkan Loading Dye. Adapun Alat-alat yang digunakan Thin Wall,Eppendorf,Lemari pendingin (refrigerator),mikropipet dan stopwatch.

    2.2.4 Elektroforesis Gel Poliakrilamid
    Alat-alat yang digunakan antara lain ; Gloves,Mikropipet,Blue Tip,Yellow Tip,Sisiran,Alat running,Shaker Machine ,Pemanas,Chamber,Plate cetakan 30 ml,sisiran 17,timbangan digital,tabung Erlenmeyer,plastic penutup,mikropipet dan oven. Sedangkan bahan yang dibutuhkan antara lain ; Bubuk agarosa 0,45 gr,TBE 30 ml dan ETBR 0,25 ml.

2.3 Cara Kerja
    2.3.1 Isolasi DNA
    Untuk Isolasi DNA,pertama siapkan terlebih dahulu sampel darah yang ingin diisolasi. Pada praktikum ini,kami menggunakan darah sapi sebagai sampel tersebut. Kemudian sebanyak 200 mikroL ditempatkan pada microtube ataupun tabung eppendorf. Setelah itu tambahkan larutan buffer lysis sebanyak 300 mikrolit menggunakan micropipet. Selanjutnya campuran tersebut divortex selama lebih kurang 10-20 detik dan dilanjutkan dengan menginkubasinya selama 10 menit.
    Setelah 10 menit,kemudian pisahkan dan ambil supernatant dari mikrotube dan letakkan di microtube yang baru dan steril. Setelah itu ditambahkan PCI sebanyak 300 mikrolit dan lakukan vortex lagi selama lebih kurang 10 detik sampai homogen. Setelah homogeny disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm suhu 25 C selama 10 menit.
    Kemudian lakukan lagi langkah seperti sebelumnya,yakni ambil supernatannya kemudian pindahkan ke mikrotube yang baru dan steril. Selanjutnya tambahkan CI sebanyak 300 mikrolit dan lakukan vortex lagi selama lebih kurang 10 detik dan dilanjutkan dengan mensentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm suhu 25 C selama 10 menit.
    Setelah itu ambil upperfase dari sampel tersebut. Kemudian pindahkan ke mikrotube baru dan steril. Dan ditambahkan Ethanol absolut sebanyak 200 mikrolit dan amunium asetat 7,5 M sebanyak 50 mikrolit,dan homogenkan dengan cara mengocok.
    Selanjutnya diinkubasi selama lebih kurag 30 menit dilanjutkan dengan mensentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm suhu 4 C selama 10 menit. Dan akan menghasilkan supernatant lagi. Dan supernatant itu dibuang kemudian dicuci pellet DNA dengan menggunakan Ethanol atau alcohol 70% sebanyak 500 mikrolit. Setelah itu disentrifugasi kembali pada kecepatan 12.000 rpm suhu 4 C selama 10 menit.
    Bagian supernatant hasil dari sentrifugasi dibuang dan tambahkan pada mikortube larutan buffer ddH2O steril (sebagai pengganti TE). Dan setelah itu masukkan ke dalam oven pada suhu 55 C selama 3 menit dan dilanjutkan dengan tahap elektroforesis.

    2.3.2 Amplifikasi DNA dengan PCR
    Langkah awal PCR antara lain membuat PCR mix solution. PCR mix solution merupakan bahan ataupun campuran dari beberapa jenis bahan kedalam thin wall. Adapun cara membuatnya dengan menambahkan ddH2o sebanyak 2 mikrolit,dan tambahkan PCR mix sebanyak 5 mikrolit serta ditambahkan DNA template atau whole genom  sebanyak 1 mikrolit. Kemudian primer reverse dan primer forward dimasukkan juga masing-masingnya sebanyak 1 mikrolit. Setelah semuanya tercampur,whole genom diencerkan menggunakan ddH2O sebanyak 20 mikrolit. Kemudian disentrifugasu dengan kecepatan lebih kurang 10.000 rpm.
    Setelah dilakukan sentrifugasi bahan tersebut dimasukkan kedalam mesin PCR/thermasl cycle dengan program 1D, dengan rincian sebagai berikut ;

1.    Pemanasan awal atau Hot Start (denaturasi awal) dengan memasukkan thin wall ke mesin PCR selama 30 menit dengan suhu 95 C
2.    Kemudian perlakuan tersebut diulang selama 33 kali yang disebut dengan siklus amplifikasi. Adapun prosesnya antara lain ; denaturasi selama 30 detik dengan suhu 95 C,Annealing selama 30 detik dengan suhu 60 C dan ekstensi selama 30 detik pada suhu 72 C
3.    Diakhiri dengan periode ekstensi selama 10 menit pada suhu 72 C.

Proses ekstensi berakhir,otomatis mesin akan otomatis tersetting 4 C hal ini terjadi demi keamanan praktikum saat mengambil thin wall di dalam mesin.

    2.3.3 Uji Polimerisme dengan Teknik RFLP
    Langkah pertama yang dilakukan yaitu memasukkan bahan-bahan yang telah disebutkan di atas kedalam Thin Wall antara lain ; Pertama masukkan ddH2O sebanyak 5 µl,kemudian masukkan juga buffer enzim 2x sebanyak 1 µl tidak lupa masukkan juga DNA hasil PCR sebanyak 3 µl serta tambahkan enzim Hind III sebanyak 1 µl. Setelah itu homogenkan dengan cara menjentik thin wall tersebut maupun memutarnya searah jarum jam atu boleh juga dengan bantuan mikropipet dengan teknik sedot semprot.
    Setelah homogen,larutan tersebut diinkubasi dalam eppendorf dengan suhu 37 C selama 1 jam ( 60 menit). Kemudian bekukan menggunakan lemari pendingin. Setelah reaksi dirasa cukup sempurna,kemudian ditambahkan Loading Dye dan elektroforesis pada suhu 100 V selama 30 menit.

    2.3.4. Elektroforesis  Gel Poliakrilamid
    Pertama bubuk gel agarosa disiapkan sebanyak 0,45 g (ditimbang menggunakan timbangan digitas). Kemudian tambahkan larutan TEB kedalam tabung Erlenmeyer selama lebih kurang 1 – 2 menit. Tabung tersebut ditutup dengan plastik. Akan tetapi pada plastic itu diberi lubang sebagai fentilasi sewaktu di dalam oven. Kemudian masukkan ke dalam oven dan ditunggu sampai mendidih. Kemudian ditunggu 2 menit sampai jernih. Setelah itu ditambahkan ETBR 0,5 – 1 mikrolit,lalu dihomogenkan dan setelah dihomogenkan dicetak pada plate 30 ml sisiran 17 dan ditunggu selama 25 menit. Selanjutnya plate dimasukkan ke dalam chamber dan plate tersebut direndam dengan TBE.


BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil
3.1.1 Isolasi DNA
Gagal,tidak ada visualisasi saat elektroforesis,dapat dilihat pada gambar diatas (kolom berwarna kuning,sedangkan sampel asisten berhasil, ada visualisasi pada kota berwarna hijau)
3.1.2 Amplifikasi DNA dengan PCR
Gagal,tidak ada visualisasi saat elektroforesis dapat dilihat gambar di atas ( kolom berwarna biru muda terlihat kosong/tidak terjadi apa-apa sedangkan milik asisten berhasil,lihat kolom berwarna hitam).
3.1.3 Uji Polimerisasi dengan Teknik RFLP
1 gagal,3 berhasil. Lihat gambar diatas,di kolom berwarna biru tua. Kelompok I gagal sedangkan kelompok 2,3 dan 4 berhasil. Cara menghitungnya dengan melihat hasil dari kolom hijau dihitung dari bawah ke atas. Dimana ditemukan 1000 bp (dimana garis pertama 300bp dan kedua 700bp)
3.1.4 Elektroforesis Gel Poliakrilamid
Berhasil,gel bisa digunakan untuk elektroforesis,terlihat di gambar,hasil elektroforesis lumayan jelas dan merata.

3.2 Pembahasan
    3.2.1 Isolasi DNA
    Percobaan Isolasi DNA yang kami lakukan pada saat praktikum tidak membuahkan hasil yang kami harapkan. Dimana tidak ditemukan pita (sebagai visualisasi keberhasilan) pada saat elektroforesis. Hal ini bisa disebabkan oleh beberapa factor antara lain ; Faktor interna,yaitu praktikan belum terbiasa melakukan praktikum yang membutuhkan ketelitian serta keakuratan pengisian bahan serta perlunya jam terbang yang lebih lama agar bisa menghasilkan isolat yang terbaik serta maksimal.
    Kesalahan selanjutnya bisa terjadi karena faktor eksternal,seperti kesalahan saat melakukan langkah kerja,misalnya saja langkahnya tidak tepat,ataupun adanya kontaminasi sehingga DNA yang seharusnya diambil supernatannya,tapi malahan ikut terbuang bersama hasil sentrifugasi yang tidak diinginkan ( dibuang). Selanjutnya juga bisa dikarenakan kesalahan dalam memasukkan bahan serta komposisinya tidak tepat serta butuhnya pengalaman dalam penggunaan alat yang masih non familier bagi mahasiswa kedokteran hewan.
    Adapun isolasi DNA itu sendiri pada dasarnya mengambil DNA murni dari sediaan yang tersedia ( Darah sapi) kemudian membuang RNA maupun protein-protein lainnya. Sehingga perbedaan berat molekul akan membuat DNA akan naik ke atas dan yang lainnya di bawah (dalam proses sentrifugasi). Pada saat penambahan buffer lysis itu dimaksudkan untuk melisiskan dinding selnya agar materi di dalamnya bisa keluar. Selanjutnya vortex bertujuan untuk mempercepat percampuran hal tersebut. Setelah tercampur secara maksimal,maka kombinasi tersebut akan disentrifugasi agar yang berat molekulnya lebih tinggi akan tersingkir ke bawah dan DNA (supernatant) akan naik ke atas,sehingga DNA murni bisa didapatkan walaupun hal tersebut diulang sampai beberapa kali.
    Adapun tahapannya yang benar sebagai berikut,pertama bahan darah sapi sebanyak 200 mikrolit dilisiskan dinding dan membrane sel dengan larutan pelisis. Pada saat praktikum kami menggunakan buffer ekstrasi (buffer lisis) sekitar 300 mikrolit. Kemudian bahan tersebut di vortex menggunakan mesin vortex selama 10 – 20 detik,hal ini bertujuan untuk mempercepat proses homogeny atau pencampuran dan perusakan sel dari darah. Sampel yang sudah tercampur tadi maka akan dilakukan inkubasi pada suhu 55 C selama 10 menit. Selanjutnya supernatant diambil dan dipindahkan ke dalam mikrotube menggunakan alat mikropipet. Bahan tersebut kemudian ditambahkan Phonel Chloroform Isoamil Alkohol (PCI) bertujuan untuk memurnikan DNA dari ekstrak sel tadi.
    Setelah itu langkah sebelumnya diulangi lagi,yaitu divortex dan disentrifugasi dengan kecepatan dan suhu yang sama seperti sebelumnya. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan DNA yang murni (terbaik) dan sentrifugasi 12.000 rpm berfungsi untuk memisahkan bahan berdasarkan berat molekulnya.
    Selanjutnya akan ditemukan fase supernatant dan pellet,sehingga harus ditambahkan Chloroform Isoamil Alkohol (CI) sebanyak 300 mikrolit,digunakan untuk purifikasi dengan cara menghilangkan kontaminan (yang ditambahkan supernatannya saja). Selanjutnya divortex dan disentrifugasi lagi dengan tujuan yang sama dengan diatas. Supernatan selanjutnya ditambahkan dengan Ethanol absolut 200 mikrolit dan amunium asestat 7,5 M sebanyak 50 mikrolit. Hal tersebut dilakukan untuk presipitasi dengan cara salting out dan ammonium asestat agar DNA menempel di mikrotube.
    3.2.2 Amplifikasi DNA dengan PCR
    Amplifikasi DNA dengan PCR berfungsi untuk memperbanyak DNA setelah hasil dari Isolasi DNA (DNA murni). Hal ini dimaksudkan agar bisa dimanfaatkan dalam penelitian karena jumlahnya lebih banyak dibanding dengan hasil isolasi. Akan tetapi pada saat praktikum,kami lagi-lagi mengalami kegagalan. Hal ini bisa dkarenakan praktikan sendiri yang baru pertama kali melakukan praktikum ini. Sehingga beberapa kesalahanpun bisa terjadi. Pertama karena kurang atau kelebihan dalam menambahkan bahan maupun salah dalam menggunakan alat sehingga hasil yang diharapkan tidak bisa terjadi. Hal itu bisa juga terjadi karena mahasiswa bercanda saat melakukan praktikum,sehingga kontaminasi misalnya dari mulut masuk secara bebas,sehingga hasil yang diharapkan tidak bisa ditemukan.
    Adapun metode yang seharusnya dilakukan antara lain : Pertama, whole genom diencerkan dengan ddH2O agar mendapatkan whole genom yang encer. Selanjutnya dilakukan pembuatn PCR mix Solution yang mengandung Taq enzim. Dimana taq enzim berfungsi untuk mengikat dNTP (yaitu basa nukleotida yang belum membentuk untai DNA atau bergerak bebas). Adapun PCR mix itu dikemas didalam LAF agar menghindari kontaminasi udara maupun bahan asing dari lingkungan luar.
    Setelah PCR mix selesai maka dimasukkan dalam thin wall dan di spin down dengan kecepatan 10.000 rpm agar cairan yang menempel di sisi tabung bisa lepas. Sehingga dosisnya akan sesuai dengan yang diinginkan.
    Kemudian masukkan PCR mix solution ke dalam mesin PCR hal inipun berfungsi sebagai meningkatkan urutan DNA. Adapun kelompok kami melakukan program 1D dimana prosesnya meliputi hot start (awal) dimana pada proses ini terjadi pemisahan rantai DNA kemudian amplifikasi yang diulang berkali-kali (33 kali) dan ketiga adalah ekstensi. Hal ini tujuan utamanya adalah mendapatkan sequence DNA yang banyak.
    3.2.3 Uji Polimerisme dengan Teknik RFLP
    Uji polimersime dengan teknik RFLP berfungsi untuk mengidentifikasi variasi variasi genetic yang ada pada DNA tersebut. Sehingga bisa memberikan hasil yang agak spesifik dari yang lainnya. Pada saat praktikum kelompok kami berhasil,diamana ditemukan pita-pita DNA yang lumayan jelas. Ditemukan 1000 dp dengan rincian garis pertama 300dp dan kedua 700dp. Akan tetapi keolompok pertama kurang berhasil karena mereka mengalami kesalahan dalam penggunaan mikropipet sehingga bahan yang dimasukkan tidak sesuai dengan takaran yang sudah ditentukan,ataupun dilakukan dengan tidak serius sehingga kontaminasi begitu besar.
    Pada metodologi dari RFLP ditambahkan ddH2O hal ini dimaksudkan untuk menjadi pelarut bahan,kemudian ditambahkan buffer lysis sebagai penyangga dan ditambahkan lagi dengan enzim hind III,hal tersebut berfungsi untuk pemotongan sequence pada DNA,dan diinkubasi. Inkubasi bertujuan untuk memaksimalkan reaksi enzimtis pada suhu kamar 37 C. Kemudian akan diinkubasi lagi dengan suhu 70 C hal itu bertujuan untuk memberhentikan reaksi (stop reaksi). Karena enzim tidak akan aktif jika suhu tinggi. Terakhir ditambahkan loading dye berfungsi untuk penanda jalan saat dilakukan elektroforesis.
    3.2.4 Elektroforesis Gel Poliakrilamid
    Elektroforesis Gel Poliakrilamid membuahkan hasil yang bagus. Dimana gel yang dihasilkan bisa digunakan saat pembacaan elektroforesis. Hal itu disebabkan agar lumayan bening dan ketebalannya masuk dalam kategori standart (bagus). Hal ini didukung dengan kehandalan mahasiswa dalam menggunakan alat serta teliti dalam memasukkan bahan-bahan yang dibutuhkan. Serta dengan bantuan asisten dosen yang professional.
    Elektroforesis Gel Poliakrilamid ini sendiri berfungsi dalam melihat molekul DNA berdasarkan berat mereka serta sebagai visualisasi dari praktikum-praktikum sebelumnya. Hal itu disebabkan pada bahan tersebut terdapat zat fluorence (dicampur gel agarosa) sehingga kalau disinari dengan ultra violet (UV) dapat menunjukkan ukuran DNA dari bahan-bahan yang diujikan di atasnya.

BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan
    Praktikum yang kami lakukan pada tanggal 05 November 2012 mengalami kegagalan antara lain di Isolasi DNA dan PCR,hal itu dikarenakan praktikan masih belum terbiasa dengan praktikum yang membutuhkan ketelitian dan kejelian tingkat tinggi serta penggunaan alat yang masih tingkat pemula sehingga beberapa hal bisa menyebabkan kegagalan. Akan tetapi pada praktikum RFLP sebagian besar mengalami keberhasilan dengan terlihatnya pita pada elektroforesis walaupun 1 kelompok gagal dikarenakan pada saat pencampuran bahan kurang benar komposisinya. Dan terakhir elektroforesis Gel Poliakrilamid sangat sukses karena bahan gel bisa digunakan untuk elektroforesis dan terlihat lumayan jelas dan ketebalan yang pas.
4.2 Saran
    Adapun saran yang harus diterapkan antara lain ;
•    Praktikum harus dilakukan dengan langkah-langkah yang tepat sesuai dengan yang diajarkan. Agar mendapatkan hasil yang maksimal
•    Jumlah komposisi dan takaran bahan harus tepat untuk mendapatkan hasil yang maksimal dan sesuai dengan yang diharapkan.
•    Pengunaan alat dan cara pemakaiannya harus benar dan sesuai dengan instruksi agar mengurangi persentase kegagalan praktikum
•    Mulai praktikum dengan berdoa